ชุดทดสอบ ELISA ของอัลฟัตโมซิน 48 test

   1. แอฟลาทอกซิน (Afl atoxin) เป็นกลุ่มของสารพิษที่สร้างโดยเชื้อรา Aspergillus flavus A. parasiticus และ A. nomius สารแอฟลาทอกซินที่สำคัญและพบเสมอในธรรมชาติมี 4 ชนิด คือ AFB1, AFB2, AFG1,และ AFG2 โดย AFB1 จะพบมากที่สุด และมีความเป็นพิษสูงสุด เพราะเป็นสารก่อมะเร็งตับทั้งในคนและในสัตว์ที่รับสารพิษเข้าไป สารพิษแอฟลาทอกซินเข้าสู่ร่างกายโดยการบริโภคอาหารที่มีการ ปนเปื้อนของสาร พิษ เนื่องจากอาหารนั้นมีการปนเปื้อนของเชื้อรา ซึ่งสามารถเกิดขึ้นได้ทุกขั้นตอนการผลิต ตั้งแต่การเก็บเกี่ยวผลิตผลเกษตร ระหว่างการเก็บรักษา และการขนส่ง ผลิตผลเกษตรที่พบว่า มีการปนเปื้อนของสารแอฟลาทอกซินได้แก่ ข้าวโพด ข้าวฟ่าง ธัญพืชต่างๆ ข้าว ข้าวสาลี ข้าวบาเลย์ พริกแห้ง ถั่วลิสง และถั่วชนิดต่าง ๆ กุ้งแห้ง ปลาแห้ง เครื่องเทศ รวมถึงผลิตภัณฑ์แปรรูปทุกชนิดที่ผลิตจาก วัตถุดิบที่มีการปนเปื้อนของสาร แอฟลาทอกซิน ดังนั้นปัญหาเกี่ยวกับการปน เปื้อนของสารแอฟลาทอกซินในอาหารคนและอาหารสัตว์ จึงจำเป็นต้องมีการควบคุมและป้องกันอย่าง มีประสิทธิภาพ วิธีการตรวจวิเคราะห์ที่รวดเร็วมีประสิทธิภาพสูง วิธีการวิเคราะห์ที่นิยมใช้ในปัจจุบันคือวิธีการวิเคราะห์ทางด้าน Immunological Assay

2. หลักการวิเคราะห์ของชุดตรวจสอบสารแอฟลาทอกซินสำเร็จรูป (DOA-ELISA Test Kit) เป็นวิธีการวิเคราะห์ทาง Immunoassay ในรูปแบบการแข่งขันแบบตรง ( Direct competitive Enzyme – Linked Immunosorbent Assay ) โดยสารแอฟลาทอกซินจะถูกสกัดออกมาจากตัวอย่างที่บดละเอียด ด้วยสารละลาย เมทธานอล แอฟลาทอกซินในสารสกัดที่กรองได้ ซึ่งเรียกว่า สารพิษอิสระ (free toxin) จะถูกนำไปแข่งขันกับสารแอฟลาทอกซินที่ผูกติดกับเอ็นไซม์ชี้บอก ( labeled toxin) ในการที่จะไปเกาะจับกับแอนตีบอดี (Antibody) ที่ถูกเคลือบไว้ที่ก้นหลุมทดสอบ (Microtitration plate) หลังจากบ่มไว้ ประมาณ 30 นาที จึงเทของเหลวในหลุมทิ้ง แล้วล้างส่วนของสารพิษอิสระ และสารพิษที่ผูกติดกับเอ็นไซม์ชี้บอก ส่วนที่ไม่เกาะจับกับแอนตีบอดี ทิ้งไป ส่วนของสารพิษที่ผูกติดกับเอ็นไซม์ชี้บอก ที่เกาะจับกับแอนตีบอดีในหลุมทดสอบ สามารถประเมินได้โดยการเติม substrate ที่จะทำปฏิกิริยาเฉพาะกับเอ็นไซม์ชี้บอก เกิดเป็นสี ความเข้มของสีที่เกิดขึ้นจากผลของปฏิกิริยาระหว่างเอ็นไซม์กับ substrate สามารถอ่านได้ด้วยสายตาเปรียบเทียบกับสีที่เกิดขึ้น ในหลุมทดสอบของสารพิษมาตรฐาน ระดับต่าง ๆ(qualitative result) หลุมทดสอบใดมีปริมาณสารพิษอิสระน้อยจะเกิดสีเข้ม ถ้ามีสารพิษ อิสระมากจะเกิดสีจางตามลำดับ การอ่านผลเป็นปริมาณสารพิษ ( quantitative result) สามารถทำได้ โดยอ่านความเข้มของสีในหลุมทดสอบ ด้วยเครื่อง Micro ELISA Reader ความเข้มของสีที่เพิ่มขึ้น จะมีความสัมพันธ์โดยตรงกับปฏิกิริยา และมีความสัมพันธ์ในทางตรงข้ามเป็นสัดส่วนกับปริมาณสารพิษที่ปนเปื้อนในตัวอย่าง

3.ชุด DOA- AFLATOXIN ELISA TEST KIT ประกอบด้วย
3.1 Micro ELISA plate แบบต่าง ๆตามความต้องการของผู้ใช้ ที่เคลือบด้วยแอนตีบอดีต่อสารแอฟลาทอกซิน B1 บรรจุอยู่ในถุงฟอยด์
3.2 AFB1-HRP Conjugate จำนวน 6 หลอด (100 ul/vial)
3.3 AFB1-HRP Conjugate จำนวน 6 หลอด (100 ul/vial)
3.4 Substrate A และ B อย่าง ละ 6 ml
3.5 Conjugate Buffer ปริมาณ 8 ml
3.6 Washing Buffer 100 ml ( 10×0.01M PBS +0.05% tween 20)

4. สิ่งที่ต้องเตรียม
4.1 เมทธานอล 70 %
4.2 เครื่องบด
4.3 เครื่องชั่ง
4.4 เครื่องปั่น หรือ เครื่องเขย่า
4.5 เครื่องแก้วสำหรับกรอง และเจือจางสารสกัด
4.6 กระดาษกรอง No. 4
4.7 ไมโครปิเปตขนาด 50-200 และ 100-1000 ไมโครลิตร พร้อมปิเปตทิป
4.8 เครื่อง MicroELISA Reader อ่านที่ความยาวคลื่น 450 นาโนเมตร

5. การเตรียมสารละลายที่ใช้ในการวิเคราะห์
5.1 การเตรียม washing buffer นำ washing buffer ในขวดมาเจือจางเป็น 0.01 M PBS-T โดยเติมน้ำกลั่น 900 มล. สำหรับนำไปใช้ในการเจือจางสารสกัดตัวอย่าง และใช้ล้าง Micro ELISA plate เก็บไว้
อุณหภูมิ 5 0 C
5.2 การเตรียม substrate solution ผสม substrate A และ substrate B ในอัตราส่วน 1:1 ควรเตรียมในปริมาณที่ต้องการ เท่านั้นและใช้ภายใน 1 ชม. ตัวอย่างเช่น ต้องการหยดในหลุมทั้งหมด 8 หลุม จะต้องใช้ substrate ทั้งหมด = 8 X 100 ไมโครลิตร (ul) ดังนั้นต้องใช้ substrate A แล substrate B อย่างละ 400 ไมโครลิตร
5.3 สารพิษมาตรฐาน พร้อมใช้ในการวิเคราะห์
5.4 การเตรียม enzyme conjugate เติม conjugate buffer 1 มล ลงไปในหลอด เอ็นไซม์ คอนจูเกต 1หลอด.เขย่าเล็ก น้อยให้เป็นเนื้อเดียวกัน หรือกลับหลอดขึ้นลงให้เข้ากัน ถ้าใช้ไม่หมดส่วนที่เหลือเก็บ
ในหลอดเดิมปิดฝาให้สนิทแล้วเก็บที่อุณหภูมิ 50C สำหรับใช้ในครั้งต่อไปได้ ส่วนเอ็น ไซม์คอนจูเกตหลอดที่ยังไม่ได้เจือจางให้เก็บไว้ที่ 0 0C
5.5 Stopping Solution พร้อมใช้ในการวิเคราะห์

6. วิธีการสกัดตัวอย่างสำหรับวิเคราะห์ ตัวอย่างที่จะนำมาสกัดเพื่อการวิเคราะห์สารพิษควรเป็นตัวอย่างที่ได้รับการ สุ่มเป็นตัวแทนที่ถูกต้องของตัวอย่างนั้น ๆ ละควรบดให้ละเอียดเป็นเนื้อเดียวกันก่อนนำมาสกัด ถ้าตัวอย่างถูกเก็บไว้ในตู้เย็น หรือตู้แช่แข็ง ต้องนำมาวางไว้ให้มีอุณหภูมิเท่ากับอุณหภูมิห้องเสียก่อนจึงจะนำไปสกัดได้ วิธีการสกัดทำได้ 2 วิธีคือ
6.1 วิธีที่การสกัดสารพิษจากตัวอย่างพร้อม ๆกันหลายตัวอย่าง
6.1.1 ชั่งตัวอย่าง ที่บดละเอียดแล้วปริมาณ 20 กรัม ใส่ใน flask
6.1.2 เติม 100 มล. ของ 70 % เมทธานอล ลงใน flask (อัตราส่วนของตัวอย่าง ต่อ 70 % เมทธานอล = 1:5 )
6.1.3 ปิดปาก flask ด้วยจุกยางหรือแผ่นพาราฟิล์ม แล้วนำไปเขย่าด้วยเครื่องเขย่าที่ความเร็ว 300 รอบต่อนาที
6.2 วิธีการสกัดสารพิษจากตัวอย่างครั้งละ 1 ตัวอย่าง 6.2.1 ชั่งตัวอย่างที่บดละเอียดแล้ว ปริมาณ 20 กรัม ใส่ลงในเครื่องปั่นน้ำผลไม้ ( blender) 6.2.2 เติม 100 มล. ของ 70% เมทธานอล (methanol) ในเครื่องปั่น ปั่นนาน 2-3 นาที
6.3 การเตรียมสารสกัดสำหรับวิเคราะห์ นำตัวอย่างที่ปั่นหรือเขย่าแล้วตั้งทิ้งไว้ประมาณ 5-10 นาทีแล้วจึงนำส่วนใสมากรองผ่านกระดาษกรองเบอร์ 4 เก็บส่วนที่กรองได้ไว้ในหลอดแก้วที่สะอาดปิดสนิท สารสกัดที่กรองได้นี้จะมีความเข้มข้นเป็น 1:5 เท่า ให้ทำการเจือจางสารสกัดเป็น 1:20 เท่า โดยใช้สารละสาย 0.01M PBS-T ก่อนนำไปวิเคราะห์ โดยเจือจางในอัตราส่วน 1:3 สารสกัดตัวอย่าง 1 มล. + สารละลาย 0.01M PBS-T 3 มล.

7. วิธีการวิเคราะห์
7.1 คำแนะนำก่อนการวิเคราะห์
7.1.1 ก่อนทำการวิเคราะห์นำสารในชุดตรวจสอบมาวางให้มีอุณหภูมิเท่ากับอุณหภูมิห้อง พร้อมทั้งสารละลายที่ใช้เจือจางสารสกัดตัวอย่าง ( 0.01M PBS-T)
7.1.2 นำเอ็นไซม์ คอนจูเกตออกมาจากช่องแช่แข็ง จำนวนหลอดเท่าที่ต้องการใช้ในแต่ละครั้ง ส่วนที่เจือจางแล้วถ้าใช้ไม่หมดปิดฝาให้สนิทและให้เก็บไว้ที่ 5 0C
7.1.3 นำ stripe ออกจากถุงฟอยด์เท่าที่ต้องการใช้ในแต่ละครั้ง stripe ที่เหลือเก็บให้ถุงเดิม ที่ 5 0C อย่าให้ถูกน้ำ
7.1.4 เปลี่ยน ทิปทุกครั้งที่เปลี่ยนการดูดสารสกัดตัวอย่าง
7.1.5 การดูดหรือปล่อยสารละลายอย่าให้ปลายทิปสัมผัสกับสารละลายในหลุม หรือด้านข้างของหลุมทดสอบ
7.1.6 ระหว่างขั้นตอนการบ่มแต่ละครั้ง ควรจะบ่มในที่มืด ที่อุณหภูมิห้อง
7.1.7 ขั้นตอนการล้างเป็นขั้นตอนที่สำคัญ อาจทำให้ผลการวิเคราะห์ไม่ถูกต้อง ดังนั้นต้องล้างหลุมทดสอบให้สะอาด
7.1.8 นำชุดตรวจสอบเก็บที่อุณหภูมิ 2-8 0C ทันทีหลังการใช้งาน
7.1.9 ควรวางแผนการใช้หลุมทดสอบเช่น จำนวนหลุมที่ใส่สารพิษมาตรฐาน และจำนวนหลุมที่ใส่สารสกัดตัวอย่าง หรือ การทำซ้ำ การกรอง สารสกัดที่กรองได ้ สารสกัดที่เจือจางเป็น 1:20
7.2 ขั้นตอนการวิเคราะห์
7.2.1 วางแผนการใช้หลุมทดสอบในแต่ละ stripe ว่าจะใช้สารพิษมาตรฐานกี่ระดับความเข้มข้น และจะใส่สารสกัดตัวอย่างในหลุมใด
7.2.2 หยด สารพิษมาตรฐานแอฟลาทอกซิน ระดับความเข้มข้นต่าง ๆ (4-5 ความเข้มข้น) ปริมาณ 50 ไมโครลิตร ลงในหลุมทดสอบ ( stripe 8 หรือ 12 ) หลุมละความเข้มข้น และหยดสารสกัดตัวอย่างที่เจือจางแล้ว ปริมาณ 50 ไมโครลิตร ลงในหลุมทดสอบที่เหลือ
7.2.3 หยด เอ็นไซม์ คอนจูเกต (AFB1-HRP conjugate) ที่เจือจางใน Conjugate Buffer แล้ว ปริมาณ 50 ไมโครลิตร ตามลงไปทุกหลุมทดสอบ เขย่าเล็กน้อย แล้วบ่มไว้ในที่มืด ที่อุณหภูมิ ห้อง นาน 30 นาที
7.2.4 หลังจากครบเวลาการบ่มแล้ว เทสารในหลุมทดสอบทิ้งโดยการคว่ำหลุม
7.2.5 ล้าง หลุมทดสอบ โดยเติม washing buffer (PBS-T) ลงในหลุมให้เต็มทุกหลุม แล้วคว่ำทิ้ง ทำการล้างอย่างน้อย 3 ครั้ง
7.2.6 คว่ำหลุมทดสอบบนกระดาษซับแล้วเคาะให้แห้ง
7.2.7 หยด substrate ที่เตรียมใหม่ๆ ตามข้อ 5.2 ปริมาณ 100 ไมโครลิตร ลงในหลุมทดสอบทุกหลุม แล้วบ่มไว้ที่อุณหภูมิห้องในที่มืดเป็นเวลา 5-10 นาที จะเกิดปฏิกิริยาเป็นสีฟ้า ตามลำดับความเข้มข้นของสารพิษ ตัวอย่างที่มีสีฟ้าเข้มแสดงว่าไม่มีสารพิษหรือมรน้อย และตัวอย่างที่มีสีฟ้าจางหรือขาว แสดงว่ามีสารพิษมาก
7.2.8 หยุดปฏิกิริยาโดยเติม stopping solution (0.5 M Phosphoric acid ) ปริมาณ100 ไมโครลิตร ปฏิกิริยาจะเปลี่ยนจากสีฟ้า เป็นสีเหลือง และอ่านค่าความเข้มของสีด้วย MicroELISA Reader ที่ช่วงความยาวคลื่น 450 นาโนเมตร ควรอ่านปฏิกิริยาภายใน 60 นาที หลังจากหยุดปฏิกิริยา

8. การคำนวณปริมาณสารพิษในตัวอย่าง ผลการวิเคราะห์สารพิษด้วยวิธี Competitive ELISA สามารถอ่านได้ทั้งแบบ คุณภาพ(qualitative) และ ปริมาณ (quantitative) ขึ้นอยู่กับจุดประสงค์ในการวิเคราะห์ ความพร้อมของแต่ละห้องปฏิบัติการ และความชำนาญของผู้ปฏิบัติการ
8.1 การอ่านผลเชิงคุณภาพ (Qualitative Result ) ถ้าต้องการอ่านผลด้วยสายตา สามารถอ่านได้ตั้งแต่ขั้นตอนที่ 7.2.7 โดยไม่ต้องหยุด ปฏิกิริยาด้วย stopping solution โดยสามารถอ่านได้จากสีฟ้าทันที โดยการเปรียบเทียบสี ฟ้าของปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นในหลุมตัวอย่างที่ ต้องการวิเคราะห์ กับสีของปฏิกิริยาที่เกิดใน หลุมของสารพิษมาตรฐาน ซึ่งค่าที่อ่านได้จะบอก เป็นปริมาณมากกว่า หรือน้อยกว่าค่าที่ กำหนดของสารพิษมาตรฐานที่ใช้เปรียบ เทียบเมื่อคูณด้วยจำนวนเท่าที่เจือจางสารสกัด ( dilution factor) แล้ว หรือไม่มีสารพิษเลย เช่น สารพิษมาตรฐานความ เข้มข้น 0, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5 พีพีบี เมื่อคูณด้วย dilution factor คือ 20 เท่า จะมีค่า เป็น 0,2,4,10,20,40 และ 100 พีพีบี ตามลำดับ ดังนั้น ความเข้มข้นของสารพิษในตัวอย่างที่ อ่านด้วยสายตาสามารถบอกได้ว่ามีปริมาณมากกว่า 10 หรือ 20 หรือ 100 พีพีบี
8.2 Quantitative Result เป็นการอ่านที่สามารถบอกได้เป็นปริมาณ พีพีบี (ส่วนในพันล้านส่วน) โดยการอ่าน ความเข้มของสีของปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นเรียกว่าค่าการดูดกลืนแสง (Absorbance Value) ด้วยเครื่องอ่าน MicroELISA Readerที่ช่วงคลื่น 450 นาโนเมตร นำค่าการดูดกลืน แสง ที่ได้ของสารพิษมาตร ฐานมาสร้าง เป็น กราฟมาตรฐาน (standard curve) โดย การเขียนค่าลงบนกระดาษ กราฟ semi-logarithmic ให้ค่าการ ดูดกลืนแสงเป็นแกน Y และค่าความเข้มข้นของสาร พิษมาตรฐานเป็นแกน X ค่าปริมาณ สารพิษจากตัวอย่าง สามารถอ่านได้จาก standard curve นั้น ๆ จากการเตรียมตัว อย่างข้างต้นตัวอย่างจะ ถูกเจือจางเป็น 1:20 ดังนั้นผลที่ ได้ต้องคูณด้วย 20 (dilution factor) ขั้นตอนการ คำนวณผลดังนี้
8.2.1 คำนวณค่าเฉลี่ยของค่าการดูดกลืนแสงของตัวอย่าง หรือสารพิษมาตรฐานที่ระดับต่าง ๆ (B) ใน กรณีที่ มีการทำซ้ำ และค่าการดูดกลืนแสงของสารพิษมาตรฐานที่ระดับความเข้มข้น 0 พีพีบี ( B0)
8.2.2. คำนวณหาค่าเปอร์เซ็นต์การดูดกลืนแสง (% maximal binding)ของสารพิษ มาตรฐานแต่ละตัว และของตัวอย่าง ดังนี้ % maximal binding = B/BO X100
8.2.3 นำค่าเปอร์เซ็นต์การดูดกลืนแสง ( B/B0) ของสารพิษมาตรฐานทุกความเข้มข้น มาพล็อตกราฟ โดยให้เค่าการดูดกลืนแสงป็นแกน y และให้ค่าความเข้มข้นของสารพิษมาตรฐานเป็นแกน x บนกระดาษ semi-logarithmic สร้างเป็นกราฟมาตรฐาน (Standard curve)
8.2.4 นำค่าเปอร์เซ็นต์การดูดกลืนแสง (B/B0) ของแต่ละตัวอย่างมาพล็อตลงบน กราฟมาตรฐาน บนแกน y (จุด I) แล้วลากเส้นตรงขนานกับแกน X มาตัด เส้น standard curve (จุดII) ลากเส้นตรงจากจุดตัด ลงมาที่แกน x (จุด III) ค่าที่อ่านได้บนแกน X ต้องคูณด้วย 20 ( dilution factor) ได้เป็นค่าความ เข้มข้นของสารพิษในตัวอย่าง เป็นปริมาณ ppb ( ug/kg หรือ ng/ml)
8.2.5 ปัจจุบันได้มีการพัฒนาโปรแกรมสำเร็จรูปโดยอาศัยหลักการดังกล่าวสำหรับ อ่านปริมาณสารพิษเป็น พีพีบี ได้โดยตรง

9 . ประสิทธิภาพของชุดตรวจสอบ
9.1 ความเฉพาะเจาะจง (Specificity) แอนตีบอดีมีความเฉพาะเจาะจงในการเกาะจับกับสารพิษแอฟลาทอกซินดังนี้ Aflatoxin B1 100.0 % Aflatoxin B2 21.4 % Aflatoxin G1 25.0 % Aflatoxin G2 2.5 %
9.2 Recovery Test ความสามารถในการตรวจจับสารแอฟลาทอกซินที่เติมลงไปในผลิตผลเกษตร 82-100 %
9.3 Sensitivity สามารถตรวจจับสารแอฟลาทอกซินได้ต่ำสุด 0.4 ppb

10 .ข้อดีของชุดตรวจสอบ
1. ตัวอย่างที่ใช้ในการทดสอบมีขั้นตอนในการเตรียมที่ง่ายไม่จำเป็นต้องมีการ clean up
2. วิธี ELISA สามารถตรวจสอบได้ครั้งละหลายตัวอย่างพร้อม ๆกัน
3. เป็นวิธีที่ง่าย สะดวก และปลอดภัยต่อผู้ปฏิบัติ
4. ใช้เวลาในการวิเคราะห์สั้น ประมาณ 1 ชม.หลังจากเตรียมตัวอย่าง
5. มีความไวในการตรวจวิเคราะห์สารพิษสูงสามารถตรวจได้ความเข้มข้นต่ำสุดถึง 0.4 ppb
6. ต้นทุนการตรวจวิเคราะห์ต่อตัวอย่างต่ำ เมื่อเทียบกับวิธีทางเคมี
7. ช่วยลดมลพิษเนื่องจากไม่ได้ใช้สารเคมีที่เป็นอันตรายเหมือนวิธีทางเคมี
8. ผลการวิเคราะห์อ่านได้ทั้งแบบ Qualitative และ Quantitative
9. สามารถใช้ตรวจหาสารแอฟลาทอกซินได้ในผลิตผลเกษตร และผลิตภัณฑ์ที่เป็นทั้งอาหาร คนและอาหารสัตว์